在 3D 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)飛速發(fā)展的今天，類器官憑借其模擬體內(nèi)器官結(jié)構(gòu)與功能的優(yōu)勢，成為研究發(fā)育、疾病機制及藥物篩選的核心模型。

然而，類器官的三維結(jié)構(gòu)也為觀測帶來挑戰(zhàn) —— 傳統(tǒng)切片成像破壞樣本完整性，常規(guī)顯微鏡難以穿透厚樣本。

“類器官 + 組織透明化 + 光片顯微鏡” 的技術(shù)組合，恰好破解了這一難題。本文結(jié)合三篇核心文獻(xiàn)，從文獻(xiàn)簡介、組織透明化方法、光片成像方案、分析結(jié)果四個維度，詳細(xì)拆解這項技術(shù)的落地應(yīng)用，為科研人員提供實用參考。

腫瘤類器官藥物篩選 —— 單細(xì)胞水平解析藥物療效差異

01文獻(xiàn)簡介

發(fā)表于《BMC Cancer》（2024）的《A spheroid whole mount drug testing pipeline with machine-learning based image analysis identifies cell-type specific differences in drug efficacy on a single-cell level》，聚焦腫瘤微環(huán)境中 “腫瘤細(xì)胞 - 成纖維細(xì)胞” 相互作用對藥物響應(yīng)的影響。研究團隊構(gòu)建了 KP-4 胰腺癌細(xì)胞與 CCD-1137Sk 成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)類器官模型，開發(fā)了一套從類器官制備、透明化、3D 成像到深度學(xué)習(xí)分析的完整流程，在單細(xì)胞水平揭示了不同細(xì)胞類型對藥物的差異性響應(yīng)。

02組織透明化方法

該研究針對腫瘤類器官（直徑可達(dá) 500μm）的厚樣本特性，采用甘油基光學(xué)透明化技術(shù)，具體步驟如下：

1.樣本預(yù)處理：類器官經(jīng) 4% 多聚甲醛（PFA）固定 1 小時后，用含 1% 胎牛血清（FBS）的 PBS 清洗，再用 0.5M 淬滅殘留固定劑，避免熒光信號干擾。

2.滲透增強：將類器官置于含 0.2% Triton X-100、0.3M 、20% DMSO 的穿透緩沖液中孵育 30 分鐘，為后續(xù)抗體滲透和透明化試劑擴散鋪路。

3.透明化處理：可平衡類器官內(nèi)部與外部環(huán)境的折射率，顯著降低光散射，確保激光能穿透 500μm 厚的類器官，同時避免樣本收縮或變形。

4.驗證環(huán)節(jié)：通過對比 “透明化類器官的光學(xué)切片” 與 “傳統(tǒng)冷凍切片” 的熒光信號（Ki-67 增殖標(biāo)記、Cleaved Caspase-3 凋亡標(biāo)記），證明透明化后不同深度（50μm、250μm、500μm）的細(xì)胞標(biāo)記率與冷凍切片無顯著差異，驗證了透明化的可靠性。

03成像方法

樣本掛載：透明化后的類器官置于含 88% 甘油的 Ibidi μ-slide 中，平衡溫度后成像，避免樣本移動或脫水。

成像參數(shù)：采用 20× 水浸物鏡（NA 0.75），激光波長覆蓋 405nm（DRAQ5 核染）、488nm（熒光抗體）、561nm（壞死標(biāo)記），z 軸步長 1μm，激光強度控制在 1-2% 以減少光毒性，同時開啟 z 補償功能，抵消深度依賴的信號衰減。

數(shù)據(jù)兼容性：也可適配光片顯微鏡的多視角成像需求 —— 若改用光片顯微鏡，僅需調(diào)整樣本掛載方式（如 FEP 管固定），即可實現(xiàn)更快的成像速度。

04分析結(jié)果

類器官生長與藥物響應(yīng)特征：

共培養(yǎng)類器官（KP-4+CCD-1137Sk）比 KP-4 單培養(yǎng)類器官生長更快，處理后，總細(xì)胞數(shù)仍高于單培養(yǎng)組，初看似乎 “共培養(yǎng)增強耐藥性”。

但單細(xì)胞水平分析揭示：成纖維細(xì)胞是耐藥核心——CCD-1137Sk 成纖維細(xì)胞對兩種藥物的耐受性顯著高于 KP-4 腫瘤細(xì)胞，說明共培養(yǎng)未增強腫瘤細(xì)胞耐藥性，反而可能通過旁分泌信號增加其敏感性。

空間分布特征：

通過 3D 殼層分析（將類器官分為內(nèi)、中、外三層），發(fā)現(xiàn)未處理組中 90% 的增殖細(xì)胞（Ki-67+）位于中外層，50-60% 的凋亡細(xì)胞位于核心；藥物處理后，共培養(yǎng)類器官核心區(qū)域的增殖細(xì)胞減少更顯著，而單培養(yǎng)類器官的凋亡細(xì)胞主要集中在外層，提示微環(huán)境影響藥物在類器官內(nèi)的滲透與作用。

乳腺類器官動態(tài)觀測 —— 

光片顯微鏡追蹤發(fā)育與信號變化

01文獻(xiàn)簡介

發(fā)表于《Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia》（2025）的《Live-cell imaging of mammary organoids using light sheet microscopy》，針對乳腺類器官的動態(tài)發(fā)育研究需求，優(yōu)化了 “類器官培養(yǎng) - 透明化 - 光片成像” 的全流程。研究以小鼠乳腺類器官（含 EKAREV-NLS 熒光報告基因或 H2B-mCherry 核標(biāo)記）為模型，開發(fā)了多視角和倒置兩種光片顯微鏡的樣本掛載方案，實現(xiàn)長達(dá) 72 小時的低光毒性實時成像，清晰捕捉乳腺類器官分支形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞增殖及信號分子動態(tài)變化，為乳腺發(fā)育生物學(xué)提供了全新觀測工具。

02組織透明化方法

考慮到乳腺類器官（部分為囊性結(jié)構(gòu)）的脆弱性，研究采用溫和透明化策略，避免破壞樣本完整性：

1.類器官包埋：若需長期存儲或高分辨率成像，采用Matrigel / 膠原 I 基質(zhì)保留策略—— 類器官嵌入含 15mg/mL 基底膜提取物（BME）和 1.5mg/mL 膠原 I 的 3D 基質(zhì)。

2.類器官組織透明化：僅用少量 88% 甘油浸潤，既維持基質(zhì)結(jié)構(gòu)，又輕度降低光散射，透明化后樣本可在 4℃存儲 1 周，-20℃存儲 6 個月。

3.關(guān)鍵驗證：對比 “無透明化活細(xì)胞成像” 與 “透明化固定成像” 的 Ki-67 標(biāo)記率，兩者無顯著差異（活細(xì)胞組 54.37±1.68% vs 透明化組 47.44±1.98%），證明透明化不影響細(xì)胞狀態(tài)評估。

03光片顯微鏡成像方法

研究核心采用多視角光片顯微鏡（ZEISS Lightsheet 7）和倒置光片顯微鏡（Luxendo TruLive3D），針對不同乳腺類器官類型設(shè)計專屬方案：

1. 多視角光片顯微鏡（適用于大體積乳腺類器官，直徑 > 300μm）

樣本掛載：類器官嵌入 FEP 管（內(nèi)徑 1.3mm，壁厚 0.15mm）中的 ECM 凝膠柱，垂直懸掛。

成像參數(shù)：采用 10× 和 20× 檢測物鏡，光片厚度 6μm，多視角（4 個角度）成像后拼接，z 軸步長 2μm。 

優(yōu)勢：可捕捉類器官 360° 全景，解決大體積樣本的 “盲區(qū)” 問題。

2. 倒置光片顯微鏡

樣本掛載：類器官置于 V 型 FEP 孔中，底部鋪薄層高濃度 ECM 凝膠（5μL Matrigel）。

成像參數(shù)：采用 20× 水浸物鏡，雙光片照明，z 軸步長 1μm。

04分析結(jié)果

乳腺類器官發(fā)育動態(tài)：

單細(xì) - 胞來源的乳腺類器官（H2B-mCherry 核標(biāo)記），光片成像清晰記錄分支延伸速度（平均 2.5μm/h）和方向，發(fā)現(xiàn)分支優(yōu)先向 ECM 凝膠疏松區(qū)域生長，提示基質(zhì)硬度影響發(fā)育方向。

藥物 / 因子處理響應(yīng)：

加入 2.5nM FGF2 后，乳腺類器官分支數(shù)量在 6 天內(nèi)增加 3 倍，光片成像追蹤到 FGF2 誘導(dǎo)的 “頂端細(xì)胞增殖 - 基底細(xì)胞遷移” 協(xié)同過程；而加入 ERK 抑制劑后，分支延伸停滯，且頂端細(xì)胞 ERK 活性降至基線水平，驗證了 ERK 信號的關(guān)鍵作用。

成像質(zhì)量與光毒性：

連續(xù) 72 小時成像后，乳腺類器官的存活率仍保持 80% 以上（Live-or-Dye 壞死標(biāo)記率 < 5%），遠(yuǎn)高于共聚焦顯微鏡（48 小時存活率 < 50%），證明光片顯微鏡的低光毒性優(yōu)勢；且成像分辨率足以區(qū)分單個細(xì)胞的核形態(tài)（如成纖維細(xì)胞的細(xì)長核 vs 上皮細(xì)胞的圓形核）。

多類型類器官通用成像 —— 

果糖 - 甘油透明化與光片技術(shù)的普適方案

01文獻(xiàn)簡介

發(fā)表于《Nature Protocols》（2019）的《High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids》，提出了一套適用于人腸道、肝臟、乳腺、氣道、腎臟類器官的通用 3D 成像 protocol。研究團隊研發(fā)了低毒性、高透明效果的 “果糖 - 甘油透明化試劑”，結(jié)合共聚焦、多光子和光片顯微鏡，實現(xiàn)從細(xì)胞骨架到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的高分辨率成像，且透明化樣本可長期存儲，為不同來源類器官的標(biāo)準(zhǔn)化成像提供了 “操作手冊” 級方案，已被廣泛應(yīng)用于疾病建模和藥物篩選研究。

02組織透明化方法

該研究的核心創(chuàng)新是果糖 - 甘油（FG）透明化試劑，具體配方與流程具有普適性：

1.透明化流程：

PFA固定：類器官經(jīng) 4% PFA 固定 45 分鐘（囊性類器官可縮短至 30 分鐘，避免塌陷），用含 0.1% Tween 20 的 PBS（PBT）清洗 3 次。

免疫標(biāo)記：（一抗 4℃孵育過夜，二抗 4℃孵育過夜），用器官清洗緩沖液（OWB：含 1% BSA、0.1% Triton X-100 的 PBS）充分清洗，去除未結(jié)合抗體。

透明化處理，室溫孵育 20 分鐘，即可成像；若需存儲，可直接置于 - 20℃，6 個月內(nèi)熒光信號無顯著衰減。

2.優(yōu)勢對比：

類器官透明化后的 DAPI 熒光強度高 3 倍，且透明化后類器官無收縮。

與無透明化相比：可使成像深度提升 2 倍（無透明化僅能穿透 100μm vs 透明化可穿透 200-500μm），且深層細(xì)胞的信號強度衰減率降低 50%。

03光片顯微鏡成像方法

研究針對不同類器官特性，適配光片顯微鏡（Zeiss Light Sheet Z.1） 的標(biāo)準(zhǔn)化方案：

樣本掛載（光片專用）：

類器官與低熔點瓊脂糖（0.4%）+ FG 試劑混合（40℃下制備），吸入玻璃毛細(xì)管（直徑 1.5mm），4℃冷卻凝固后，將毛細(xì)管置于光片成像 chamber 中，chamber 內(nèi)填充 FG 試劑，避免樣本脫水。

成像參數(shù)：

 10×（NA 0.2）和檢測物鏡 20×（NA 1.0，適配 透明化試劑的折射率），光片厚度 6μm，雙光片照明以減少陰影，z 軸步長 1-2μm，根據(jù)類器官大小調(diào)整成像范圍（腸道類器官需 z 范圍 500μm，氣道類器官需 300μm）。

多模態(tài)兼容：

若類器官含熒光報告基因（如 H2B-mNeonGreen），可直接成像；若需免疫標(biāo)記，可在透明化前完成，透明化過程不影響抗體結(jié)合效率（如 E - 鈣粘蛋白標(biāo)記率與未透明化組一致，均為 95% 以上）。

04分析結(jié)果

| 三維可視化：組織透明化后類器官三維成像相較于二維成像的優(yōu)勢，能夠清晰呈現(xiàn)類器官樣本的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征。

| 成像深度與熒光強度加深：透明化步驟后，與未進(jìn)行透明化處理的樣本相比，類器官成像的熒光強度顯著增強，且 z 軸方向的成像穿透深度也有所提升。

| 3D細(xì)胞亞型定量分析：能夠支持細(xì)胞分割算法對整個類器官中細(xì)胞的數(shù)量以及不同細(xì)胞亞型中各類細(xì)胞標(biāo)志物的存在情況進(jìn)行定量分析

類器官組織透明化解決方案

01組織透明化的高深度、高質(zhì)量，高通量類器官平臺

快速透明化—僅需5-10min即可透明化500um 厚的樣品

溫和光學(xué)透明化—對熒光標(biāo)記組織進(jìn)行透明化用于 3D 成像后，對檢測靈敏度或樣品形態(tài)的影響小

工作流程兼容性—無需其他設(shè)備或儀器即可輕松實現(xiàn)

平臺兼容性—與大多數(shù)熒光染料和標(biāo)準(zhǔn)熒光成像儀器兼容

光片顯微平臺—實現(xiàn)高分辨類器官三維可視化

02組織透明化相關(guān)產(chǎn)品